肝胆相照：胆汁酸提醒你肝病“来袭”
慢性肝病为全球高发疾病，隐匿性强，病程长，在没有发展到很严重的地步时，自身难以察觉，而一旦爆发，便可能是“致命一击”，需要有效可行的预防和监测方法。目前，胆汁酸已被证实为慢性肝病的重要标志物，但还缺少可靠且广泛适用于预测或诊断的特征指标。
对此，绘云生物研究团队开展了覆盖慢性肝病6个阶段的大型队列研究，确定了与慢性肝病进展相关的结合型胆汁酸比值特征，并构建出有效鉴别不同阶段慢性肝病的诊断模型。此研究成果已发表在《Journal of Gastroenterology and Hepatology》。
肝脏以胆固醇为原料合成初级游离型胆汁酸：胆酸、鹅脱氧胆酸，游离型胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合，形成初级结合型胆汁酸：GCA（甘氨胆酸）、TCA（牛磺胆酸）、GCDCA（甘氨鹅脱氧胆酸）、TCDCA（牛磺鹅脱氧胆酸）。
初级结合型胆汁酸通过胆盐输出泵“泵”入胆囊，再随胆汁排入肠腔。在肠菌作用下，初级结合型胆汁酸经去结合以及脱羟基反应生成次级游离型胆汁酸：脱氧胆酸、石胆酸以及微量的熊脱氧胆酸。
胆汁酸的肠肝循环
肠道中的各种胆汁酸被重吸收入血并运回肝脏后，再次与甘氨酸或牛磺酸结合，形成次级结合型胆汁酸：GDCA（甘氨脱氧胆酸）、TDCA（牛磺脱氧胆酸）、GLCA（甘氨石胆酸）、TLCA（牛磺石胆酸）、GUDCA（甘氨熊脱氧胆酸）、TUDCA（牛磺熊脱氧胆酸）。
已有证据表明这些结合型胆汁酸与慢性肝病进展相关，绘云生物研究团队针对不同阶段的慢性肝病，进一步对这些结合型胆汁酸水平以及GCA/TCA,GCDCA/TCDCA,GDCA/TDCA,GLCA/TLCA谷丙甘氨酸胶囊和GUDCA/TUDCA这5个比值进行检测分析，找到与慢性肝病进展相关的新特征。
绘云生物研究团队进行了3个队列研究谷丙甘氨酸胶囊，分别是：NAFL（非酒精性脂肪肝）、NASH（非酒精性脂肪性肝炎）阶段的结合型胆汁酸变化研究；肝纤维化阶段的结合型胆汁酸变化研究；以及肝癌阶段的结合型胆汁酸变化研究。
发现集1、队列一研究：NAFL、NASH阶段中结合型胆汁酸的变化
122名受试者参与此队列研究，包括33名NAFL患者、54名NASH患者和3谷丙甘氨酸胶囊5名健康对照者。
如表格1所示，慢性肝病患者年龄较大，BMI水平高于健康对照组，男性多于女性。在NAFL、NASH组中，与肝功能相关的特征水平：ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、GGT（谷氨酰转肽酶）和TG（甘油三酯）逐渐升高。
表格1
而表格S1显示，TBA（总胆汁酸）水平和5个结合型胆汁酸比值存在统计意义，TBA和结合型胆汁酸水平逐渐升高。
表格S1
在这5个比值特征中，GCA/TCA、GDCA/TDCA和GUDCA/TUDCA在3组中有所不同。GCA/TCA和GDCA/TDCA的水平随着疾病的严重程度而改变，表明它们有可能作为疾病进展的指标。
图1：队列一各组的甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸绝对浓度和比例
2、队列二研究：肝纤维化中结合型胆汁酸的变化
709名受试者参与此队列研究，包括324名0-3期肝纤维化患者、58名4期肝纤维化（肝硬化）患者和327名健康对照者。
受试者临床特征如表格2所示，男性多于女性，肝硬化患者比健康对照者和纤维化患者年龄大。
大多数与肝功能相关特征指标在3组之间和每2组之间不同，与健康对照者相比，纤维化和肝硬化患者ALT、AST、GGT、DBIL（直接胆红素）、TBIL（总胆红素）和IBIL（间接胆红素）水平更高，与队列一研究保持一致。
表格2
在对照组、肝纤维化组和肝硬化组中，TBA、甘氨酸结合型和牛磺酸结合型胆汁酸水平逐渐增加（表格S2，图2）。有趣的是，与健康对照相比，肝纤维化和肝硬化患者的牛磺酸结合型胆汁酸水平较高，而甘氨酸结合型胆汁酸水平较低（图2）。
表格S2
图2：队列二各组的甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸绝对浓度和比例
GCA/TCA、GCDCA/TCDCA、GLCA/TLCA在3组和任意2组之间存在差异。 GCDCA/TCDCA水平随着疾病的严重程度逐渐降低，表明其有可能作为纤维化的指标。
3、队列三研究：肝癌中结合型胆汁酸的变化
761名受试者参与此队列研究，包括659名肝癌患者（529名肝细胞癌患者、55名肝内胆管癌患者、75名肝腺瘤患者）和102名健康对照者。
如表格3所示，所有类型肝癌患者都比健康对照组年龄大，男性多于女性。与队列一和队列二类似，大多数肝功能相关特征指标在肝癌患者中高于健康对照者。
表格3
肝癌患者TBA水平和结合型胆汁酸水平高于健康对照者（表格S3和图3）。与健康对照者相比，所有患者的牛磺酸结合型胆汁酸比例较高，甘氨酸结合型胆汁酸比例较低。
GCA/TCA和GCDCA/TCDCA在5组之间以及任何类型的癌症患者与健康对照者之间存在差异。与健康对照者相比，肝癌患者的GCDCA/TCDCA水平始终较低，表明其可能作为肝癌指标。
表格S3
图3：队列三各组的甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸绝对浓度和比例
验证集确定慢性肝病发病和进展的标志物
为探索慢性肝病的长期进展并筛选出可靠的临床应用标志物，绘云生物研究团队结合前3项研究的比值数据（假设批次效应通过比值特征消除），考虑到GCA/TCA,GCDCA/TCDCA和GDCA/TDCA三个比值在上述研究中的一致性，将其确定为疾病潜在标志物。
三个比值在6个慢性肝病阶段和3种类型肝癌中的变化如图4所示。
图4：在慢性肝病进展过程中，GCA/TCA (a)、GDCA/TDCA (b)和GCDCA/TCDCA (c)的水平
GCA/TCA和GDCA/TDCA变化趋势相似，NAFL和NASH组逐渐升高，肝纤维化组急剧下降，随后各组均保持低水平，表明GCA/TCA和GDCA/TDCA有可能成为NAFL和NASH分期的指标，可用于从健康人群中识别早期慢性肝病（NAFL和NASH）或区分早期和晚期慢性肝病（肝纤维化、肝癌）。
GCDCA/TCDCA水平在健康对照组、NAFL和NASH组中相当。肝纤维化组显着下降，肝硬化及肝癌组维持在较低水平，表明GCDCA/TCDCA有可能成为早期和晚期慢性肝病的指标。
不过，无论是在晚期慢性肝病还是在3种肝癌之间，这些比值都没有显著改变，这表明结合型胆汁酸比例高低可能更有利于早期慢性肝病的诊断和监测。
基于上述发现，构建3个二元逻辑回归模型区分健康对照者和早期慢性肝病患者（模型 1）、早期和晚期慢性肝病患者（模型 2）以及NAFL和NASH患者（模型 3）。此外，年龄和性别参与模型构建，因为它们被认为是与慢性肝病进展高度相关的因素。
收集并检测291份独立测试样本，包括110名健康对照者和12名NAFL、21名NASH、34名肝纤维化（0-3 期）、19名肝硬化和95名肝细胞癌患者。结果中，3个标志物的改变与发现集变化一致，并进行ROC分析（表格4和图5）。
表格4
图5
总体而言，所有模型auROC（ROC下面积）范围为0.91至0.98，kappa指数范围为0.65至0.89，精度范围为0.88至0.95。年龄和性别的加入提高了模型的诊断性能。发现集和测试集性能相当。来自测试集的 auROC的95%CI相对较大，可能是因为样本量较小。
模型1
最佳auROC达到0.98 [0.94, 1]，用于区分健康和早期慢性肝病，敏感性、特异性和准确性分别为0.96、0.91和0.94。
模型2
最佳auROC为0.97 [0.94, 0.99]，用于区分早期和晚期慢性肝病，灵敏度、特异性和准确度分别为0.91、0.92和0.93。
模型3
区分NAFL和NASH的最佳auROC为 0.94 [0.81, 1]，灵敏度、特异性和准确度分别为0.92、1.00和0.88。
综上所述，本研究发现的胆汁酸比值特征和诊断模型对于慢性肝病不同阶段的鉴别具有良好的性能。
本研究共有1592名受试者参与，包括健康、NAFL、NASH、肝纤维化、肝硬化和肝癌（3类肝癌）人群，对甘氨酸结合型和牛磺酸结合型胆汁酸的水平以及5种甘氨酸与牛磺酸胆汁酸的比值进行检测。
筛选出3个结合型胆汁酸比值：GCA/TCA，GCDCA/TCDCA和GDCA/TDCA，结合年龄和性别，高精度地区分健康对照者和早期慢性肝病、晚期慢性肝病、NAFL和NASH患者，并通过独立测试集成功验证。
本研究结果揭示了特定慢性肝病阶段的胆汁酸扰动模式，并为监测肝病进展提供了新的生物标志物和工具。
对此，绘云生物研究团队开展了覆盖慢性肝病6个阶段的大型队列研究，确定了与慢性肝病进展相关的结合型胆汁酸比值特征，并构建出有效鉴别不同阶段慢性肝病的诊断模型。此研究成果已发表在《Journal of Gastroenterology and Hepatology》。
肝脏以胆固醇为原料合成初级游离型胆汁酸：胆酸、鹅脱氧胆酸，游离型胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合，形成初级结合型胆汁酸：GCA（甘氨胆酸）、TCA（牛磺胆酸）、GCDCA（甘氨鹅脱氧胆酸）、TCDCA（牛磺鹅脱氧胆酸）。
初级结合型胆汁酸通过胆盐输出泵“泵”入胆囊，再随胆汁排入肠腔。在肠菌作用下，初级结合型胆汁酸经去结合以及脱羟基反应生成次级游离型胆汁酸：脱氧胆酸、石胆酸以及微量的熊脱氧胆酸。
胆汁酸的肠肝循环
肠道中的各种胆汁酸被重吸收入血并运回肝脏后，再次与甘氨酸或牛磺酸结合，形成次级结合型胆汁酸：GDCA（甘氨脱氧胆酸）、TDCA（牛磺脱氧胆酸）、GLCA（甘氨石胆酸）、TLCA（牛磺石胆酸）、GUDCA（甘氨熊脱氧胆酸）、TUDCA（牛磺熊脱氧胆酸）。
已有证据表明这些结合型胆汁酸与慢性肝病进展相关，绘云生物研究团队针对不同阶段的慢性肝病，进一步对这些结合型胆汁酸水平以及GCA/TCA,GCDCA/TCDCA,GDCA/TDCA,GLCA/TLCA谷丙甘氨酸胶囊和GUDCA/TUDCA这5个比值进行检测分析，找到与慢性肝病进展相关的新特征。
绘云生物研究团队进行了3个队列研究谷丙甘氨酸胶囊，分别是：NAFL（非酒精性脂肪肝）、NASH（非酒精性脂肪性肝炎）阶段的结合型胆汁酸变化研究；肝纤维化阶段的结合型胆汁酸变化研究；以及肝癌阶段的结合型胆汁酸变化研究。
发现集1、队列一研究：NAFL、NASH阶段中结合型胆汁酸的变化
122名受试者参与此队列研究，包括33名NAFL患者、54名NASH患者和3谷丙甘氨酸胶囊5名健康对照者。
如表格1所示，慢性肝病患者年龄较大，BMI水平高于健康对照组，男性多于女性。在NAFL、NASH组中，与肝功能相关的特征水平：ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、GGT（谷氨酰转肽酶）和TG（甘油三酯）逐渐升高。
表格1
而表格S1显示，TBA（总胆汁酸）水平和5个结合型胆汁酸比值存在统计意义，TBA和结合型胆汁酸水平逐渐升高。
表格S1
在这5个比值特征中，GCA/TCA、GDCA/TDCA和GUDCA/TUDCA在3组中有所不同。GCA/TCA和GDCA/TDCA的水平随着疾病的严重程度而改变，表明它们有可能作为疾病进展的指标。
图1：队列一各组的甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸绝对浓度和比例
2、队列二研究：肝纤维化中结合型胆汁酸的变化
709名受试者参与此队列研究，包括324名0-3期肝纤维化患者、58名4期肝纤维化（肝硬化）患者和327名健康对照者。
受试者临床特征如表格2所示，男性多于女性，肝硬化患者比健康对照者和纤维化患者年龄大。
大多数与肝功能相关特征指标在3组之间和每2组之间不同，与健康对照者相比，纤维化和肝硬化患者ALT、AST、GGT、DBIL（直接胆红素）、TBIL（总胆红素）和IBIL（间接胆红素）水平更高，与队列一研究保持一致。
表格2
在对照组、肝纤维化组和肝硬化组中，TBA、甘氨酸结合型和牛磺酸结合型胆汁酸水平逐渐增加（表格S2，图2）。有趣的是，与健康对照相比，肝纤维化和肝硬化患者的牛磺酸结合型胆汁酸水平较高，而甘氨酸结合型胆汁酸水平较低（图2）。
表格S2
图2：队列二各组的甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸绝对浓度和比例
GCA/TCA、GCDCA/TCDCA、GLCA/TLCA在3组和任意2组之间存在差异。 GCDCA/TCDCA水平随着疾病的严重程度逐渐降低，表明其有可能作为纤维化的指标。
3、队列三研究：肝癌中结合型胆汁酸的变化
761名受试者参与此队列研究，包括659名肝癌患者（529名肝细胞癌患者、55名肝内胆管癌患者、75名肝腺瘤患者）和102名健康对照者。
如表格3所示，所有类型肝癌患者都比健康对照组年龄大，男性多于女性。与队列一和队列二类似，大多数肝功能相关特征指标在肝癌患者中高于健康对照者。
表格3
肝癌患者TBA水平和结合型胆汁酸水平高于健康对照者（表格S3和图3）。与健康对照者相比，所有患者的牛磺酸结合型胆汁酸比例较高，甘氨酸结合型胆汁酸比例较低。
GCA/TCA和GCDCA/TCDCA在5组之间以及任何类型的癌症患者与健康对照者之间存在差异。与健康对照者相比，肝癌患者的GCDCA/TCDCA水平始终较低，表明其可能作为肝癌指标。
表格S3
图3：队列三各组的甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸绝对浓度和比例
验证集确定慢性肝病发病和进展的标志物
为探索慢性肝病的长期进展并筛选出可靠的临床应用标志物，绘云生物研究团队结合前3项研究的比值数据（假设批次效应通过比值特征消除），考虑到GCA/TCA,GCDCA/TCDCA和GDCA/TDCA三个比值在上述研究中的一致性，将其确定为疾病潜在标志物。
三个比值在6个慢性肝病阶段和3种类型肝癌中的变化如图4所示。
图4：在慢性肝病进展过程中，GCA/TCA (a)、GDCA/TDCA (b)和GCDCA/TCDCA (c)的水平
GCA/TCA和GDCA/TDCA变化趋势相似，NAFL和NASH组逐渐升高，肝纤维化组急剧下降，随后各组均保持低水平，表明GCA/TCA和GDCA/TDCA有可能成为NAFL和NASH分期的指标，可用于从健康人群中识别早期慢性肝病（NAFL和NASH）或区分早期和晚期慢性肝病（肝纤维化、肝癌）。
GCDCA/TCDCA水平在健康对照组、NAFL和NASH组中相当。肝纤维化组显着下降，肝硬化及肝癌组维持在较低水平，表明GCDCA/TCDCA有可能成为早期和晚期慢性肝病的指标。
不过，无论是在晚期慢性肝病还是在3种肝癌之间，这些比值都没有显著改变，这表明结合型胆汁酸比例高低可能更有利于早期慢性肝病的诊断和监测。
基于上述发现，构建3个二元逻辑回归模型区分健康对照者和早期慢性肝病患者（模型 1）、早期和晚期慢性肝病患者（模型 2）以及NAFL和NASH患者（模型 3）。此外，年龄和性别参与模型构建，因为它们被认为是与慢性肝病进展高度相关的因素。
收集并检测291份独立测试样本，包括110名健康对照者和12名NAFL、21名NASH、34名肝纤维化（0-3 期）、19名肝硬化和95名肝细胞癌患者。结果中，3个标志物的改变与发现集变化一致，并进行ROC分析（表格4和图5）。
表格4
图5
总体而言，所有模型auROC（ROC下面积）范围为0.91至0.98，kappa指数范围为0.65至0.89，精度范围为0.88至0.95。年龄和性别的加入提高了模型的诊断性能。发现集和测试集性能相当。来自测试集的 auROC的95%CI相对较大，可能是因为样本量较小。
模型1
最佳auROC达到0.98 [0.94, 1]，用于区分健康和早期慢性肝病，敏感性、特异性和准确性分别为0.96、0.91和0.94。
模型2
最佳auROC为0.97 [0.94, 0.99]，用于区分早期和晚期慢性肝病，灵敏度、特异性和准确度分别为0.91、0.92和0.93。
模型3
区分NAFL和NASH的最佳auROC为 0.94 [0.81, 1]，灵敏度、特异性和准确度分别为0.92、1.00和0.88。
综上所述，本研究发现的胆汁酸比值特征和诊断模型对于慢性肝病不同阶段的鉴别具有良好的性能。
本研究共有1592名受试者参与，包括健康、NAFL、NASH、肝纤维化、肝硬化和肝癌（3类肝癌）人群，对甘氨酸结合型和牛磺酸结合型胆汁酸的水平以及5种甘氨酸与牛磺酸胆汁酸的比值进行检测。
筛选出3个结合型胆汁酸比值：GCA/TCA，GCDCA/TCDCA和GDCA/TDCA，结合年龄和性别，高精度地区分健康对照者和早期慢性肝病、晚期慢性肝病、NAFL和NASH患者，并通过独立测试集成功验证。
本研究结果揭示了特定慢性肝病阶段的胆汁酸扰动模式，并为监测肝病进展提供了新的生物标志物和工具。
